核酸分離純化的原則
 

　　核酸在細(xì)胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的。核酸的分離主要是指將核酸與蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等生物大分子物質(zhì)分開。
 

　　在分離核酸時(shí)應(yīng)遵循以下原則:保證核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性;排除其他分子污染。 核酸分離與純化的步驟 大多數(shù)核酸分離與純化的方法一般都包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟。每一步驟又可由多種不同的方法單獨(dú)或聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。
 

　　1. 細(xì)胞裂解:核酸必須從細(xì)胞或其他生物物質(zhì)中釋放出來。細(xì)胞裂解可通過機(jī)械作用、化學(xué)作用、酶作用等方法實(shí)現(xiàn)。
 

　　(1) 機(jī)械作用:包括低滲裂解、超聲裂解、微波裂解、凍融裂解和顆粒破碎等物理裂解方法。這些方法用機(jī)械力使細(xì)胞破碎,但機(jī)械力也可引起核酸鏈的斷裂,因而不適用于高分子量長鏈核酸的分離。有報(bào)道超聲裂解法提取的核酸片段長度從< 500bp ～ > 20kb 之間,而顆粒勻漿法提取的核酸一般< 10kb。
 

　　(2) 化學(xué)作用:在一定的p H 環(huán)境和變性條件下,細(xì)胞破裂,蛋白質(zhì)變性沉淀,核酸被釋放到水相。上述變性條件可通過加熱、加入表面活性劑或強(qiáng)離子劑 而獲得。
 

　　而p H 環(huán)境則由加入的強(qiáng)堿(NaOH) 或緩沖液提供。在一定的p H 環(huán)境下,表面活性劑或強(qiáng)離子劑可使細(xì)胞裂解、蛋白質(zhì)和多糖沉淀,緩沖液中的一些金屬離子螯合劑可螯合對(duì)核酸酶活性所必須的金屬離子Mg2+ 、Ca2+ ,從而抑制核酸酶的活性,保護(hù)核酸不被降解。
 

　　(3) 酶作用:主要是通過加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或鏈酶蛋白酶) 以使細(xì)胞破裂,核酸釋放。
 

　　蛋白酶還能降解與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì),促進(jìn)核酸的分離。其中溶菌酶能催化細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸殘基間的β-(1 ,4) 鍵水解。
 

　　蛋白酶K能催化水解多種多肽鍵，其在65 ℃及有EDTA、尿素(1～4mol/ L) 和去污劑(0. 5 %SDS 或 1 %Triton X-100) 存在時(shí)仍保留酶活性，這有利于提高對(duì)高分子量核酸的提取效率。在實(shí)際工作中，酶作用、機(jī)械作用、化學(xué)作用經(jīng)常聯(lián)合使用。具體選擇哪種或哪幾種方法可根據(jù)細(xì)胞類型、待分離的核酸類型及后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膩泶_定。
 

　　2. 酶處理:在核酸提取過程中,可通過加入適當(dāng)?shù)拿甘共恍枰奈镔|(zhì)降解,以利于核酸的分離與純化。如在裂解液中加入蛋白酶(蛋白酶K 或鏈酶蛋白酶) 可以降解蛋白質(zhì)，滅活核酸酶(DNase 和RNase) ,DNase 和RNase 也用于去除不需要的核酸。
 

　　3. 核酸的分離與純化:核酸的高電荷磷酸骨架使其比蛋白質(zhì)、多糖、脂肪等其他生物大分子物質(zhì)更具親水性,根據(jù)它們理化性質(zhì)的差異,用選擇性沉淀、層析、密度梯度離心等方法可將核酸分離、純化。